數字PCR在食品研究中的應用
來(lái)源：本站 作者：zhangyang 時(shí)間：2025/2/19
數字PCR在食品研究中的應用
數字PCR（dPCR）作為一種高靈敏度、高特異性的分子檢測技術(shù)，近年來(lái)在食品研究領(lǐng)域展現出巨大的潛力。它能夠精確量化食品中微量目標DNA，快速識別和定量食品中的致病菌、轉基因成分及其他重要指標。通過(guò)數字PCR，研究人員不僅可以提高檢測的準確性，還能縮短檢測時(shí)間，為食品安全監測和質(zhì)量控制提供有力支持。在本期文章中，我們將深入探討數字PCR在食品研究中的具體應用案例，以及它如何推動(dòng)食品安全和質(zhì)量的提升。
數字PCR原理
數字PCR（dPCR）是一種基于PCR（聚合酶鏈反應）技術(shù)的定量分析方法，其原理是將待擴增的DNA樣本分配到大量微小反應室中，每個(gè)反應室中可能含有零個(gè)或一個(gè)目標DNA分子。通過(guò)進(jìn)行PCR擴增，只有含有目標DNA的反應室會(huì )產(chǎn)生熒光信號。最終，通過(guò)統計陽(yáng)性反應室的數量，利用泊松分布公式，可以精確計算出樣本中目標DNA的絕對拷貝數。這種方法具有高靈敏度和高特異性，能夠有效克服傳統PCR在定量分析中的局限性。
數字PCR與食品研究
數字PCR在食品研究領(lǐng)域的應用眾多，以下選取幾個(gè)常用的應用展開(kāi)討論。
轉基因食品檢測
我國非常重視轉基因食品安全問(wèn)題，已建立了一套嚴格規范的農業(yè)轉基因生物安全評價(jià)和監管制度。我國對轉基因食品實(shí)行按目錄定性強制標識制度。
2023年10月17日《農業(yè)農村部關(guān)于修改農業(yè)轉基因生物標識管理辦法的決定（征求意見(jiàn)稿）》，其中，一項新規定引起關(guān)注，即“單一作物轉基因成分含量超過(guò)產(chǎn)品3%時(shí)應當標識”。根據意見(jiàn)稿這一規定，我國轉基因食品標識或將由“定性標識”改為“定量標識”，并設置3%的閾值。
隨著(zhù)轉基因生物使用的增加，含有轉基因生物的基質(zhì)也變得越來(lái)越復雜。最常見(jiàn)的基于DNA的轉基因生物檢測和定量方法是實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(qPCR)。然而，由于qPCR對抑制劑敏感，且定量依賴(lài)于標準曲線(xiàn)，在復雜基質(zhì)的轉基因生物定量中應用有限。
為了克服這一障礙，研究者們[1]提出了針對“抗農達”大豆和大豆內參基因的液滴數字PCR (ddPCR)檢測方法。對四個(gè)真實(shí)樣本的適用性研究和基于室的PCR系統的使用表明，dPCR在改進(jìn)轉基因生物檢測和食品真實(shí)性監測方面具有巨大的潛力。
dPCR定量，抗抑制，無(wú)需標準品，靈敏度高
食品中病原體鑒定
病毒
乙型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）作為引起人類(lèi)急性病毒性肝炎的重要原因，通過(guò)受污染食品的傳播在工業(yè)化國家中尤為突出。傳統的實(shí)時(shí)定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）技術(shù)雖在病毒檢測中發(fā)揮著(zhù)重要作用，但在食品樣品中病毒濃度低和抑制物質(zhì)存在的情況下，其定量能力受限。
研究人員[2]開(kāi)發(fā)了一種基于ddPCR技術(shù)的雙重檢測方法，用于食品中HEV的定量檢測，檢測限（LOD）達到0.34 copies/μL。
同時(shí)，研究團隊將新開(kāi)發(fā)的ddPCR方法應用于自然污染的野豬肉樣本分析。結果顯示ddPCR方法能夠準確確認樣本的陽(yáng)性和陰性狀態(tài)，并且在病毒滴度較低的樣本中，ddPCR提供了更精確的定量結果。這表明ddPCR技術(shù)在檢測食品中低濃度HEV RNA方面具有明顯優(yōu)勢。
數字PCR技術(shù)以其無(wú)需標準曲線(xiàn)、精確定量的優(yōu)勢，為食品中病毒的檢測和定量提供了新的解決方案。ddPCR技術(shù)通過(guò)將樣品稀釋并分配到成千上萬(wàn)的小滴中，每個(gè)小滴獨立進(jìn)行PCR擴增，從而實(shí)現對目標DNA分子的絕對定量。與傳統的RT-qPCR相比，ddPCR不受擴增效率的影響，減少了食品樣品中抑制物質(zhì)對病毒定量的干擾，提供了更高的精確度和靈敏度。
細菌
在食品安全領(lǐng)域，準確檢測食品中的病原體是保障消費者健康的關(guān)鍵。然而，傳統的檢測方法往往存在局限性，特別是在面對病原體處于可存活但不可培養（Viable but Non-Culturable, VBNC）狀態(tài)時(shí)。近期，一項發(fā)表在《OncoTargets and Therapy》上的研究[3]，利用數字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）技術(shù)，對面粉中沙門(mén)氏菌（Salmonella Typhimurium）的VBNC狀態(tài)進(jìn)行了定量檢測和生存分析，為食品安全檢測提供了新的技術(shù)手段。
沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的食源性病原體，可導致嚴重的食品安全問(wèn)題。在VBNC（可存活但不可培養）狀態(tài)下，細菌雖然代謝活躍，但無(wú)法通過(guò)常規的培養方法檢測，這給食品安全檢測帶來(lái)了巨大挑戰。
使用ddPCR，對面粉樣本中的沙門(mén)氏菌進(jìn)行了定量檢測。實(shí)驗結果表明ddPCR 技術(shù)能夠有效區分VBNC狀態(tài)的沙門(mén)氏菌，并準確評估其在不同環(huán)境條件下的生存狀態(tài)。
研究結果顯示，ddPCR技術(shù)在檢測VBNC狀態(tài)的沙門(mén)氏菌時(shí)，展現出了比qPCR更高的靈敏度（3copies/μL）和準確性。在評估細胞活性方面，ddPCR與熒光顯微鏡的結果一致，進(jìn)一步證實(shí)了其在食品安全檢測中的潛力。
這項研究不僅證實(shí)了ddPCR技術(shù)在檢測VBNC狀態(tài)病原體中的有效性，也為食品安全檢測提供了新的策略。通過(guò)ddPCR技術(shù)，可以更準確地評估食品中病原體的風(fēng)險，從而為消費者提供更安全的食源性產(chǎn)品。
食品中微生物鑒定
乳酸菌參與了肉、奶、魚(yú)、蔬菜等食品的自發(fā)發(fā)酵。它們是人類(lèi)胃腸道的共生居民，對人類(lèi)健康有貢獻。作為益生菌，乳酸菌已顯示出有益的作用，如預防腹瀉和炎癥性腸病。乳酸菌的定量對流行病學(xué)研究及其在各種利基市場(chǎng)中的作用具有重要意義。
研究者[4]評估了基于分子基因的ddPCR檢測方法在植物乳桿菌亞種檢測中的適用，將ddPCR的性能特征與定量實(shí)時(shí)PCR (qPCR)的性能特征進(jìn)行比較。結果表明：ddPCR技術(shù)展現出比qPCR更高的靈敏度，能夠檢測到更低濃度的乳酸菌。ddPCR技術(shù)不需要標準曲線(xiàn)，能夠直接提供目標DNA分子的絕對數量，且ddPCR在檢測限和定量限方面均優(yōu)于qPCR。
食品中過(guò)敏源鑒定
芝麻作為一種重要的過(guò)敏原，其在食品中的微量存在可能引發(fā)敏感個(gè)體的嚴重過(guò)敏反應。因此，能夠準確檢測食品中芝麻的存在變得尤為重要。然而，傳統的檢測方法在靈敏度和精確度上存在局限，難以滿(mǎn)足高標準的檢測需求。
研究者們[5]開(kāi)發(fā)了兩種ndPCR方法，針對芝麻的CO6b-1和ITS區域，實(shí)現了在面團/餅干中5和0.1 mg/kg的芝麻檢測靈敏度。這一靈敏度比實(shí)時(shí)PCR提高了整整一個(gè)數量級，且不受食品加工過(guò)程的影響。
結果顯示，無(wú)論是在原始面團還是經(jīng)過(guò)烘焙處理的餅干中，ndPCR技術(shù)都能穩定地檢測到目標DNA，展現了出色的線(xiàn)性、精確度和靈敏度。 與傳統的實(shí)時(shí)PCR相比，ndPCR技術(shù)不受PCR抑制劑的影響，提供絕對定量，無(wú)需使用校準曲線(xiàn)。這項技術(shù)通過(guò)將反應液隨機高度分割成個(gè)體分區，根據熒光信號判斷分區是陽(yáng)性還是陰性，從而計算目標DNA的絕對數量。
研究者還將ndPCR技術(shù)應用于商業(yè)樣品的檢測，包括餅干、糕點(diǎn)、能量棒和香腸等，證明了該技術(shù)在實(shí)際食品檢測中的潛力。這些結果不僅為食品生產(chǎn)者提供了一種新的工具，也有助于保護過(guò)敏體質(zhì)消費者的飲食安全。
隨著(zhù)ndPCR技術(shù)的不斷發(fā)展，我們期待它能夠被應用于更廣泛的過(guò)敏原食品檢測，包括樹(shù)堅果、花生、大豆、小麥、魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)動(dòng)物、牛奶等。此外，ndPCR技術(shù)在多重檢測方面的潛力也值得進(jìn)一步探索，以實(shí)現對多種過(guò)敏原的同時(shí)檢測。
食品中品種鑒定
肉類(lèi)
肉類(lèi)產(chǎn)品的真實(shí)性和可追溯性是確保食品和錯誤標簽(例如包括來(lái)自非申報物種的肉類(lèi))安全的首要問(wèn)題。食品摻假(例如，在肉末中添加廉價(jià)的切塊)在世界范圍內經(jīng)常發(fā)生。
研究者[6]應用ddPCR法對肉制品中的牛肉、豬肉、馬、羊、雞肉和火雞肉進(jìn)行檢測和定量(copy/uL)。對商品肉類(lèi)進(jìn)行的分析顯示，除了公布的DNA外，還存在其他動(dòng)物物種的DNA痕跡。詳見(jiàn)下表。
結果表明，該方法具有較高的靈敏度、特異性和準確度(準確度100%)。主管食品安全部門(mén)可以采用該方法來(lái)驗證肉制品標簽的符合性，并確保從初級生產(chǎn)到消費的整個(gè)肉類(lèi)供應鏈的質(zhì)量和安全。
農作物
中國最常見(jiàn)的淀粉類(lèi)型是馬鈴薯、紅薯、木薯、玉米和小麥。價(jià)格差異會(huì )導致淀粉摻假。木薯淀粉是較為昂貴的淀粉摻假的主要原料，因此需要靈敏的檢測技術(shù)來(lái)檢測和阻止摻假。淀粉的檢測主要包括感官檢測和理化檢測。然而，這些檢測方法耗時(shí)費力，無(wú)法測量摻假程度。
研究者[7]采用液滴數字PCR (ddPCR)技術(shù)鑒定淀粉產(chǎn)品中的木薯?yè)郊?。分析表明?/span>ddPCR方法檢測，木薯質(zhì)量(M)與木薯提取DNA含量呈顯著(zhù)線(xiàn)性關(guān)系，DNA含量與DNA拷貝數(C)也呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)構建的摻假模型驗證了該方法的準確性和應用潛力。
結論：該方法可定量測定市售淀粉的摻假程度。ddPCR也可以應用于廣泛的摻假檢測。
保健品
食品摻假往往導致消費者不信任和不公平的商業(yè)競爭。保健食品原料粉的交易形式容易摻假，因此，需要一種有效的粉末產(chǎn)品檢測和定性分析方法。
本研究[8]旨在建立、優(yōu)化和驗證一種基于液滴數字PCR (ddPCR)的三七主根粉的準確鑒定和定量方法，為三七質(zhì)量控制提供依據。選取單拷貝核基因二?；视图っ?/span>1基因，設計三七特異性引物和探針。以DNA濃度為換算因子，建立了以DNA拷貝數為基礎確定三七粉質(zhì)量的方程。通過(guò)對已知三七散成分的混合粉末樣品進(jìn)行分析，驗證了ddPCR方法的準確性。為了驗證該方法的適用性，同時(shí)對市售產(chǎn)品進(jìn)行了檢測。
該方法精密度高，適用于三七散的定性和定量分析。該方法可作為三七散質(zhì)量控制的有效工具。
參考文獻
[1] Kosir A B , Demsar T , Stebih D ,et al.Digital PCR as an effective tool for GMO quantification in complex matrices[J].Food Chemistry, 2019, 294(OCT.1):73-78.
[2] La Bella, Gianfranco, et al. "Duplex Droplet Digital PCR Assay for Quantification of Hepatitis E Virus in Food." Viruses 16.3 (2024): 413.
[3] Li, Liyan, and Sungwoo Bae. "Quantitative detection and survival analysis of VBNC Salmonella Typhimurium in flour using droplet digital PCR and DNA-intercalating dyes." Microbiology Spectrum 12.8 (2024): e00249-24.
[4] Choi, Chang-Hun, et al. "Comparison of Real-Time PCR and Droplet Digital PCR for the Quantitative Detection of Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum." Foods 11.9 (2022): 1331.
[5] Villa, Caterina, Joana Costa, and Isabel Mafra. "First nanoplate digital PCR method to trace allergenic foods: Improved sensitivity for the detection of sesame." Food Chemistry 444 (2024): 138650.
[6] Application of the novel Droplet digital PCR technology for identification of meat species[J].International Journal of Food Science & Technology, 2020, 55(3).
[7] Chen J , Zhang Y , Chen C ,et al.Identification and quantification of cassava starch adulteration in different food starches by droplet digital PCR[J].PLoS ONE, 2020, 15(2):e0228624.
[8] Yu, Ning, et al. "A novel analytical droplet digital PCR method for identification and quantification of raw health food material powder from Panax notoginseng." Food Analytical Methods 14 (2021): 552-560.
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