數字PCR在環(huán)境水體研究中的應用-實(shí)驗技術(shù)-廣州吉源生物科技有限公司

實(shí)驗技術(shù)

數字PCR在環(huán)境水體研究中的應用

來(lái)源：本站作者：zhangyang 時(shí)間：2025/2/26

在當今環(huán)境科學(xué)研究中，數字PCR（dPCR）作為一種高靈敏度、高特異性的分子檢測技術(shù)，正逐漸成為監測水體污染的重要工具。隨著(zhù)全球水資源短缺和水污染問(wèn)題的日益嚴重，傳統的水質(zhì)檢測方法已難以滿(mǎn)足快速、準確的需求。數字PCR通過(guò)對目標DNA分子的精確計數，不僅能夠有效識別水體中的微生物和污染物，還能為生態(tài)保護和水資源管理提供科學(xué)依據。本文將探討數字PCR在環(huán)境水體研究中的應用前景及其帶來(lái)的變革。

一、數字PCR的原理

數字PCR（dPCR）是一種基于PCR（聚合酶鏈反應）技術(shù)的定量分析方法，其原理是將待擴增的DNA樣本分配到大量微小反應室中，每個(gè)反應室中可能含有零個(gè)或一個(gè)目標DNA分子。通過(guò)進(jìn)行PCR擴增，只有含有目標DNA的反應室會(huì )產(chǎn)生熒光信號。最終，通過(guò)統計陽(yáng)性反應室的數量，利用泊松分布公式，可以精確計算出樣本中目標DNA的絕對拷貝數。

這種方法具有高靈敏度和高特異性，能夠有效克服傳統PCR在定量分析中的局限性。

二、數字PCR與水體研究

1、水產(chǎn)養殖

微生物在有機物去除和氮循環(huán)中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用，同時(shí)也可能產(chǎn)生有毒的硫化氫（H2S），如果它們對魚(yú)類(lèi)有致病性或具備益生菌特性，可能會(huì )直接影響?hù)~(yú)類(lèi)健康。目前水產(chǎn)養殖中用于監測某些細菌種類(lèi)的數量的方法通常精度、特異性、靈敏度較低，并且耗時(shí)較長(cháng)。

研究人員^[1]用ddPCR分析了與鮭魚(yú)生產(chǎn)相關(guān)的3類(lèi)細菌，分別是魚(yú)類(lèi)病原體、可從海產(chǎn)品轉移到人身上的人類(lèi)病原體，以及破環(huán)飼養環(huán)境威脅魚(yú)類(lèi)健康的細菌。最后得出結論，數字PCR不僅能對極低含量的細菌gDNA進(jìn)行定量，而且在復雜樣品中依舊能保持如單個(gè)樣品一致的檢測精確性。

2、魚(yú)類(lèi)種群豐度

測量水樣中環(huán)境DNA (eDNA)濃度有可能是一種既經(jīng)濟高效又無(wú)損的估計魚(yú)類(lèi)種群豐度的方法。然而，水生系統中固有的非生物和生物條件的時(shí)空變異性被認為是確定魚(yú)類(lèi)eDNA濃度與魚(yú)類(lèi)種群豐度之間關(guān)系的主要障礙。

研究人員^[2]將ddPCR方法獲得的魚(yú)類(lèi)eDNA (COI線(xiàn)粒體區域，134 bp)濃度與魚(yú)類(lèi)種群豐度(即個(gè)體數量)和生物量的高精度估計進(jìn)行了比較。結果顯示，在第三次采樣時(shí)間（ST3），刺魚(yú)eDNA濃度與個(gè)體豐度（即魚(yú)類(lèi)數量）和生物量之間發(fā)現了正相關(guān)關(guān)系（見(jiàn)圖2）。同樣，在第四次采樣時(shí)間（ST4），刺魚(yú)eDNA濃度和豐度及生物量之間也發(fā)現了正相關(guān)關(guān)系（見(jiàn)圖）。

結論：研究強調了基于ddPCR的eDNA是未來(lái)自然系統中魚(yú)類(lèi)種群豐度量化的一種有前途的方法。

對海洋中鯨、海豚和鼠海豚的物種、亞種或種群進(jìn)行基因取樣鑒定仍然具有挑戰性。大多數樣本都是通過(guò)某種形式的活組織檢查收集的，當個(gè)體在表面時(shí)需要近距離接近血管。另一群科研人員[3]采用數字PCR技術(shù)，利用從海水中采集的環(huán)境DNA進(jìn)行鯨類(lèi)動(dòng)物的檢測和物種鑒定。結果證實(shí)了在鯨魚(yú)身后長(cháng)達2小時(shí)內檢測到eDNA的潛力。

海洋中采樣外置和數字PCR檢測結果

3、魚(yú)類(lèi)的定性與定量

（1）定性——真假鑒別

高價(jià)值銀鯧魚(yú)(Pampus argenteus)的摻假是世界范圍內一個(gè)嚴重的問(wèn)題，需要對該物種進(jìn)行準確的鑒定和定量。

研究人員^[4]通過(guò)建立一種ddPCR方法，檢測銀鯧魚(yú)。結果表明ddPCR的絕對檢測限和定量限分別為 2 copies/μl和 21 copies/μl。對肉類(lèi)混合物的靈敏度為0.1%，對DNA混合物的靈敏度為0.5%。ddPCR的敏感性是real-time PCR的156倍。

本研究中建立的ddPCR方法可以成為解決物種摻假問(wèn)題的有價(jià)值的工具。

同樣，大西洋三文魚(yú)因其獨特的口感和豐富的營(yíng)養價(jià)值而受到全球消費者的青睞。然而，由于市場(chǎng)需求巨大，價(jià)格較高的大西洋三文魚(yú)常常被價(jià)格較低的虹鱒魚(yú)摻假或替代，這不僅損害了消費者的利益，也帶來(lái)了潛在的健康風(fēng)險。

傳統的檢測方法，如形態(tài)學(xué)特征識別、光譜和色譜技術(shù)，雖然在一定程度上能夠識別魚(yú)類(lèi)品種，但存在特異性和靈敏度不足的問(wèn)題。而基于DNA的檢測方法，尤其是實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR），雖然在定性和定量檢測中表現出色，但仍受限于擴增效率和DNA模板純度的影響。研究者^[5]建立了一種基于液滴數字PCR (ddPCR)檢測的大西洋三文魚(yú)與虹鱒魚(yú)摻假的精確鑒別和定量方法。與實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)檢測相比，所建立的ddPCR方法具有更高的穩定性和準確性?？傮w而言，基于ddpcr的定量方法具有較高的準確性、穩定性、靈敏度和實(shí)用性，適合用于鮭魚(yú)產(chǎn)品的常規監測和質(zhì)量保證。

（2）定量

鱈魚(yú)的需求量上升，品種鑒定和含量估算對食品的真實(shí)性和質(zhì)量評價(jià)具有重要意義。

研究者采用液滴數字PCR技術(shù)，建立了阿拉斯加鱈魚(yú)在海產(chǎn)品中的含量測定方法。利用該方法，發(fā)現原始樣品質(zhì)量、DNA濃度和DNA拷貝數之間存在線(xiàn)性關(guān)系。還建立了一個(gè)公式來(lái)計算原始樣品的重量，基于DNA拷貝的數量。

本研究結果表明，所描述的ddPCR方法適用于海鮮產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚(yú)的定量，并具有應用于食品質(zhì)量認證的各種任務(wù)的潛力。

4、水中病原體-水質(zhì)監測

軍團菌引發(fā)的疾病在全球范圍內呈上升趨勢，這使得監測飲用水中的軍團菌成為公共衛生領(lǐng)域的一項重要任務(wù)。然而，現有的監測策略主要依賴(lài)于基于培養的方法，傳統的培養方法耗時(shí)長(cháng)、精度低，而基于PCR的方法雖然快速，但可能同時(shí)檢測到活細胞和死細胞的遺傳物質(zhì)。

研究者^[6]使用了兩種常見(jiàn)的商業(yè)DNA提取試劑盒（方法A和方法B），對來(lái)自家庭淋浴器的水樣和生物膜樣品進(jìn)行了處理。

結果顯示，數字PCR技術(shù)（ddPCR）以其高靈敏度、精確度和無(wú)需標準曲線(xiàn)的優(yōu)勢，為病原菌的監測提供了新的解決方案。

相關(guān)文獻表明^[7]，dPCR越來(lái)越多地用于測定糞便指示菌、微生物源跟蹤標記基因和各種水生環(huán)境中的病原體。

優(yōu)化的dPCR分析方法可以定量微生物的遺傳物質(zhì)，而不需要校準曲線(xiàn)，并且通常具有比定量聚合酶鏈反應(qPCR)更好的分析性能(即更高的靈敏度、精度和可重復性)。

5、藻類(lèi)

奧得河發(fā)生一起由單細胞藻類(lèi)土棲藻引起的有害藻華事件，導致了大規模魚(yú)類(lèi)及其他生物的死亡。這種藻類(lèi)能產(chǎn)生名為prymnesins的毒素，對水生生物具有極高的毒性。研究團隊通過(guò)一系列先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，對這一生態(tài)災難進(jìn)行了深入分析。

研究人員[8]從奧得河的兩個(gè)監測站點(diǎn)收集了水樣，并利用ddPCR技術(shù)進(jìn)行了分析。結果顯示，樣本中檢測到的P. parvum ITS2拷貝數最高，達到了約1.14×10⁹拷貝/升。這一結果與顯微鏡計數的細胞密度相吻合，證實(shí)了ddPCR技術(shù)在環(huán)境樣本中的有效性。

結論：本文建立的微滴數字PCR試驗將有助于未來(lái)監測奧得河或任何其他受鹽影響和微咸水體中低水平的細小瘧原蟲(chóng)。

參考文獻

[1] Netzer L D T .Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR[J].Journal of Microbiological Methods, 2021, 183(1).

[2] Capo, Eric, et al. "Droplet digital PCR applied to environmental DNA, a promising method to estimate fish population abundance from humic‐rich aquatic ecosystems." Environmental DNA 3.2 (2021): 343-352.

[3] Baker, C. Scott, et al. "Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales: Droplet digital PCR for detection and species identification." Frontiers in Marine Science 5 (2018): 133.

[4] Cao, Weiwei, et al. "Species identification and quantification of silver pomfret using the droplet digital PCR assay." Food chemistry 302 (2020): 125331.

[5] Ma, X. Y., Shao, Z. L., Yu, X. P., & Wang, Z. L. (2023). A Droplet Digital PCR-Based Approach for Quantitative Analysis of the Adulteration of Atlantic Salmon with Rainbow Trout. Foods, 12(23), 4309.

[6] Cavallaro, Alessio, et al. "The impact of DNA extraction on the quantification of Legionella, with implications for ecological studies." Microbiology Spectrum 12.8 (2024): e00713-24.

[7] Tiwari, Ananda, et al. "Application of digital PCR for public health-related water quality monitoring." Science of the Total Environment 837 (2022): 155663.

[8] Mora, Demetrio, et al. "From genes to toxins: Profiling Prymnesium parvum during a riverine harmful algal bloom." Harmful Algae 136 (2024): 102644.

臻準數字芯片式PCR

1.微腔式（反應單元物理分割）

2.儀器系統多款選擇

3.產(chǎn)品優(yōu)勢

①10x的buffer,上樣量可以控制到2-17μL，對于低濃度和高濃度樣本都可以適用。

②樣本利用率高，可以達到95%。漏檢的可能性小，其他品牌有可能是60%左右，低濃度時(shí)有可能漏檢。

③可以用染料法SYBR Green I，其他品牌染料法做的比較差，只能用EvaGreen

④儀器小巧、通量靈活、價(jià)格便宜

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