來(lái)源：本站 作者：jiyuanbio 時(shí)間：2025/2/19

Western Blot 實(shí)驗是什么？

Western Blot 實(shí)驗，又叫蛋白質(zhì)免疫印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗方法，在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域占據著(zhù)舉足輕重的地位 。它就像是蛋白質(zhì)世界里的 “超級偵探”，能夠從復雜的蛋白質(zhì)混合物中精準地找出目標蛋白。

在科研的眾多領(lǐng)域，比如生物醫學(xué)研究中，科學(xué)家們想要了解某種疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)變化，或者在藥物研發(fā)中，探究藥物對蛋白質(zhì)表達的影響，Western Blot 實(shí)驗都能大顯身手。它主要有兩大關(guān)鍵作用，一是定性分析，判斷目標蛋白是否存在；二是半定量分析，比較不同樣本中目標蛋白表達量的相對高低 。比如在研究腫瘤細胞和正常細胞的差異時(shí)，通過(guò) Western Blot 實(shí)驗，就能知道某些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)在兩種細胞中的表達情況，是腫瘤細胞中表達量升高，還是正常細胞中表達量更高，從而為腫瘤的診斷和治療提供重要線(xiàn)索。

樣本制備：實(shí)驗的基石

樣本制備是 Western Blot 實(shí)驗的開(kāi)篇之作，其重要性如同基石之于高樓。這一步驟的成功與否，直接關(guān)系到后續實(shí)驗能否順利進(jìn)行。只有制備出高質(zhì)量的樣本，才能為后續的蛋白質(zhì)分析提供可靠的基礎。

在樣本制備過(guò)程中，裂解液的選擇是首要關(guān)鍵。不同的蛋白質(zhì)定位需要不同的裂解液，就像不同的鎖需要不同的鑰匙。比如，對于全細胞蛋白的提取，NP-40、Triton X-100 或 RIPA 裂解液較為常用；而細胞質(zhì)（可溶）蛋白，Tris-HCl 裂解液更為合適 。一旦樣品開(kāi)始裂解，蛋白降解、去磷酸化和變性也隨即開(kāi)始，所以樣本裂解過(guò)程中要全程保持低溫（冰上或 4℃），所使用的試劑和耗材要提前預冷，并且裂解前幾分鐘要向裂解緩沖液中加入合適的酶抑制劑來(lái)減緩這些反應。

樣本制備還有諸多注意事項。裂解液緩沖液 pH 值要合適，一般采用接近生理 pH 的緩沖液，如 Tris-HCl、PBS 等，pH 值太低或太高都有可能引起蛋白的變性、析出。蛋白提取時(shí)盡量保證不同樣品的鹽濃度一致，鹽離子濃度不一致會(huì )導致蛋白條帶寬窄不一；同時(shí)裂解液的鹽離子濃度不能太高，一般采用接近生理狀態(tài)的鹽離子濃度，防止蛋白鹽析；樣本鹽濃度比較高還會(huì )導致蛋白往兩邊擴散，使得條帶越來(lái)越寬，最后條帶連在一起；也可能會(huì )導致泳道內部電流偏大，最后出現笑臉的條帶。根據目的蛋白定位選擇合適的去垢劑裂解液，常見(jiàn)的去垢劑有 Triton X-100、NP40、SDS 等，不同的裂解液提取強度不同，其中 SDS 及其他離子型去垢劑的裂解液溶解能力最強，最有可能獲得最高的得率，但是會(huì )破壞蛋白 - 蛋白之間的相互作用，不適合 Co-IP 或者 Pull down 這類(lèi)實(shí)驗，如果想盡量保護蛋白 - 蛋白相互作用，避免蛋白變性，需要選擇溫和的非離子型去垢劑（例如 Triton X-100），或者直接用 Tris-HCl，PBS 這類(lèi)不含去垢劑的緩沖液借助物理破碎提取可溶蛋白 。提取的樣本要盡可能新鮮，裂解前幾分鐘加相應的酶抑制劑，提取時(shí)間要充足，提取全過(guò)程要保持低溫操作，使用的試劑和耗材要提前遇冷，提取后的樣本保存過(guò)程中要避免多次反復凍融。

凝膠制備：打造優(yōu)質(zhì)分離平臺

凝膠制備是 Western Blot 實(shí)驗中至關(guān)重要的一環(huán)，它直接關(guān)乎到蛋白質(zhì)的分離效果，就如同搭建舞臺，只有舞臺搭建得穩固、合適，后續的 “表演”（蛋白質(zhì)分離與檢測）才能精彩呈現。

在制備凝膠時(shí)，均一膠的制備尤為關(guān)鍵。要確保凝膠濃度均勻一致，這需要在配制過(guò)程中充分攪拌各種試劑，讓它們完美融合。不同濃度的凝膠適用于不同分子量范圍的蛋白質(zhì)。低濃度的凝膠（如 5%），就像寬敞的大道，更適合大分子量的蛋白質(zhì)（大于 200 kDa）在其中遷移；中等濃度的凝膠（10%-12%）則像是城市里的主干道，通常用于分離中等分子量范圍的蛋白質(zhì)（25-200 kDa）；而高濃度的凝膠（15% 或更高）如同狹窄的小巷，適合分離小分子量的蛋白質(zhì)（小于 25 kDa） 。比如，當我們研究的目標蛋白是分子量較大的膠原蛋白時(shí)，就需要選擇低濃度的凝膠，讓它能夠在凝膠中順利遷移，與其他雜質(zhì)蛋白分離開(kāi)來(lái)。

在制膠過(guò)程中，AP（過(guò)硫酸銨）和 TEMED（四甲基乙二胺）的用量控制是一個(gè)要點(diǎn)。AP 是引發(fā)劑，TEMED 是加速劑，它們共同作用促使丙烯酰胺聚合形成凝膠。用量過(guò)多，凝膠會(huì )迅速聚合，可能導致凝膠不均勻，還會(huì )產(chǎn)生過(guò)多的自由基，對蛋白質(zhì)造成損傷；用量過(guò)少，聚合速度過(guò)慢，甚至可能無(wú)法聚合。聚合時(shí)間的把控也不容忽視。聚合時(shí)間過(guò)短，凝膠未完全凝固，在后續電泳過(guò)程中容易變形，影響蛋白分離效果；聚合時(shí)間過(guò)長(cháng)，凝膠會(huì )變脆，同樣不利于實(shí)驗進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，在室溫下，凝膠的聚合時(shí)間在 30 分鐘到 1 小時(shí)左右，不過(guò)具體時(shí)間還需根據實(shí)際情況進(jìn)行調整。制膠時(shí)要隔絕氧氣，因為氧氣會(huì )抑制凝膠的聚合，所以在灌膠后，通常會(huì )在膠液表面覆蓋一層水或異丙醇，形成一個(gè)無(wú)氧的環(huán)境，助力凝膠順利聚合。

電泳：蛋白分離的關(guān)鍵環(huán)節

電泳是 Western Blot 實(shí)驗中分離蛋白的關(guān)鍵環(huán)節，它就像是一場(chǎng)精彩的賽跑，不同分子量的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的驅動(dòng)下，在凝膠這個(gè) “跑道” 上展開(kāi)激烈角逐，從而實(shí)現分離。

在進(jìn)行上樣與電泳時(shí)，諸多要點(diǎn)需要牢記。為了實(shí)時(shí)觀(guān)察電泳進(jìn)程，判斷蛋白分子量大小，同時(shí)檢驗轉膜效果，使用預染蛋白 Marker 是個(gè)不錯的選擇。比如，在研究某種未知蛋白質(zhì)時(shí)，通過(guò)預染蛋白 Marker，就能直觀(guān)地看到不同分子量的標準蛋白在凝膠中的遷移位置，從而推測出未知蛋白的分子量范圍 。

上樣時(shí)，要盡量保證每個(gè)泳道的蛋白量一致，體積也盡量相同。這就好比給每個(gè)參賽選手提供相同的裝備和資源，讓比賽更加公平。如果蛋白量差異過(guò)大，就像有的選手負重過(guò)多，有的選手則輕裝上陣，會(huì )導致條帶的亮度和寬度出現明顯差異，影響后續的分析判斷。一般來(lái)說(shuō)，對于全細胞裂解液，上樣量在 20 - 50 μg 較為合適；對于純化的蛋白，上樣量可以在 1 - 5 μg 。

如果有空置的泳道，一定要用等體積的 1x Loading Buffer 補齊，這一小小的舉動(dòng)卻有著(zhù)重要作用。它能平衡電場(chǎng)，防止電場(chǎng)不均勻導致最后的一兩個(gè)樣品條帶上揚，就像給天平的兩端放上相同重量的砝碼，讓天平保持平衡。

在電泳過(guò)程中，也可能會(huì )遇到一些問(wèn)題。比如，電壓過(guò)高，蛋白質(zhì)在凝膠中跑得過(guò)快，就像賽跑選手速度過(guò)快，容易失控，可能會(huì )導致條帶變形、分辨率降低；電壓過(guò)低，電泳時(shí)間過(guò)長(cháng)，不僅浪費時(shí)間，還可能會(huì )使蛋白質(zhì)擴散，條帶變寬 。如果出現條帶彎曲或拖尾的情況，可能是凝膠制備不均勻，就像跑道坑洼不平，影響選手的奔跑；也可能是緩沖液離子強度不對，需要重新檢查緩沖液的配方并新鮮配制。

轉膜：蛋白轉移的精細操作

 

轉膜是 Western Blot 實(shí)驗中不可或缺的關(guān)鍵步驟，它肩負著(zhù)將在凝膠中分離的蛋白質(zhì)精準轉移到固相膜上的重任，為后續的抗體檢測搭建起關(guān)鍵的橋梁。轉膜的原理基于蛋白質(zhì)的帶電特性，在電場(chǎng)的強大驅動(dòng)下，帶負電荷的蛋白質(zhì)從凝膠有序地遷移至膜上 。這一過(guò)程就像是一場(chǎng)精心策劃的搬遷行動(dòng)，讓蛋白質(zhì)從凝膠這個(gè) “臨時(shí)住所” 順利轉移到膜這個(gè) “新家”，并且在轉移過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持其在凝膠中的相對位置和分辨率，為后續的抗體識別和檢測奠定堅實(shí)基礎。

在轉膜方法的選擇上，主要有濕轉、快速濕轉和半干轉這幾種主流方式。常規濕轉，如同一場(chǎng)在 “水世界” 里的轉移之旅，通過(guò)制作 “海綿墊 - 濾紙 - 膜 - 凝膠 - 濾紙 - 海綿墊” 這樣的三明治夾板結構，放入充滿(mǎn)轉膜緩沖液的轉膜槽中，在電場(chǎng)力的強力作用下，蛋白質(zhì)從凝膠緩緩轉移到膜上 。它的優(yōu)點(diǎn)十分顯著(zhù)，轉膜效果極為完全，就像搬家時(shí)所有物品都能被妥善安置，因此應用廣泛，是眾多科研人員的常用之選。然而，常規濕轉也存在一些小缺點(diǎn)，所需時(shí)間較長(cháng)，就像一場(chǎng)漫長(cháng)的搬家過(guò)程，可能會(huì )耗費較多的時(shí)間和耐心。而快速濕轉能在一定程度上解決時(shí)間長(cháng)的問(wèn)題，比如中科通儀就有相關(guān)的快速濕轉設備，能夠滿(mǎn)足一些對時(shí)間有更高要求的實(shí)驗場(chǎng)景 。半干轉則與濕轉有所不同，它在固定膠 / 膜疊層及施加電場(chǎng)的儀器上另辟蹊徑。其優(yōu)點(diǎn)是轉膜速度較快，能夠在較短的時(shí)間內完成蛋白質(zhì)的轉移，就像一場(chǎng)高效的快速搬家。但它也有不足之處，對于某些蛋白質(zhì)的轉膜效率可能略低于濕轉，在轉移過(guò)程中可能會(huì )出現一些小狀況，導致部分蛋白質(zhì)的轉移效果不夠理想。

在轉膜過(guò)程中，有諸多注意事項需要我們格外關(guān)注。膜的選擇至關(guān)重要，Western Blot 實(shí)驗中常用的轉印膜主要有 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）和 NC 膜（硝酸纖維素膜） 。PVDF 膜機械強度高，化學(xué)相容性好，靈敏度高，分辨率和蛋白親和力都很出色，尤其適合分子量較小的蛋白質(zhì)檢測，就像一把精準的 “小蛋白探測器”。不過(guò)，它通常需要用甲醇 / 乙醇預先活化，在使用前需要多一道準備工序。NC 膜則背景低，可結合蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行各種印跡應用，是一種較為經(jīng)濟實(shí)用的選擇 。但它對于分子量較小的蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)容易丟失，且韌性較差，操作時(shí)需要格外小心，否則容易破碎。在選擇膜時(shí)，還需要考慮膜的孔徑大小。通常，Western Blot 轉印膜有 0.2μm 和 0.45μm 兩種孔徑 。0.2μm 的膜如同一張細密的濾網(wǎng)，更適合小于 20kD 的蛋白或低豐度蛋白的檢測；而 0.45μm 的膜則像是一張普通的濾網(wǎng)，更常用，適合大于 20kD 的蛋白。

在操作過(guò)程中，要小心避免氣泡的產(chǎn)生。氣泡就像隱藏在轉膜過(guò)程中的 “小搗蛋”，會(huì )阻礙蛋白質(zhì)的正常轉移，導致轉膜不均勻，出現條帶缺失或變形等問(wèn)題。我們可以在組裝轉膜三明治結構時(shí)，用玻璃棒輕輕滾動(dòng)，將氣泡趕出，確保蛋白質(zhì)能夠順利轉移。

溫度的控制也不容忽視。轉膜過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生熱量，如果溫度過(guò)高，就像給蛋白質(zhì) “蒸桑拿”，可能會(huì )導致蛋白質(zhì)變性，影響后續的檢測結果。我們可以使用冰袋或凝膠狀冷卻包來(lái)提供有效的降溫，讓蛋白質(zhì)在一個(gè)舒適的 “溫度環(huán)境” 中完成轉移。

電極方向的正確性也至關(guān)重要。如果電極方向接反，就像指南針指錯了方向，蛋白質(zhì)不僅無(wú)法順利轉移，還可能會(huì )反向遷移，導致實(shí)驗失敗。所以在轉膜前，一定要仔細檢查電極方向，確保萬(wàn)無(wú)一失。

免疫檢測：精準識別目標蛋白

免疫檢測是 Western Blot 實(shí)驗的關(guān)鍵環(huán)節，它就像一場(chǎng)精準的 “蛋白質(zhì)識別游戲”，利用抗原抗體特異性結合的原理，從眾多蛋白質(zhì)中精準地找出目標蛋白。這一過(guò)程就像是在茫茫人海中尋找特定的某個(gè)人，而抗體就是那把獨一無(wú)二的 “鑰匙”，能夠準確地開(kāi)啟目標蛋白這把 “鎖” 。

在免疫檢測過(guò)程中，封閉是重要的第一步。封閉的目的是用無(wú)關(guān)蛋白填充膜上的空白位點(diǎn)，防止抗體非特異性結合，就像用填充物填滿(mǎn)房間的空隙，讓抗體只能與目標蛋白結合 。常見(jiàn)的封閉液有 5% 脫脂奶粉和 3% BSA（牛血清白蛋白）。對于一般的蛋白質(zhì)檢測，5% 脫脂奶粉是經(jīng)濟實(shí)惠的選擇；而在檢測磷酸化蛋白時(shí)，由于奶粉中含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），可能會(huì )導致背景信號過(guò)高，所以更推薦使用 3% BSA 作為封閉液 。

抗體孵育是免疫檢測的核心步驟。一抗是與目標蛋白特異性結合的抗體，它的濃度和孵育時(shí)間對實(shí)驗結果有著(zhù)至關(guān)重要的影響?？贵w濃度過(guò)高，就像在房間里放了太多的人，可能會(huì )導致非特異性結合增加，背景信號增強；抗體濃度過(guò)低，則可能會(huì )使目標蛋白無(wú)法被充分識別，信號變弱 。孵育時(shí)間也需要根據實(shí)際情況進(jìn)行調整，一般來(lái)說(shuō)，室溫孵育 1 - 2 小時(shí)或者 4℃過(guò)夜孵育都是常見(jiàn)的選擇。4℃過(guò)夜孵育雖然時(shí)間較長(cháng)，但可以讓抗體與目標蛋白充分結合，提高檢測的靈敏度 。二抗是與一抗結合的抗體，它通常帶有標記物，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或熒光素，用于后續的信號檢測。二抗的選擇要與一抗的來(lái)源物種相匹配，比如一抗是小鼠來(lái)源的，二抗就應該選擇抗小鼠的抗體 。

洗膜是免疫檢測過(guò)程中不可或缺的步驟，它的作用是去除未結合的抗體和雜質(zhì)，確保檢測結果的準確性。洗膜時(shí)要使用合適的洗膜液，如 TBST（Tris 緩沖鹽溶液加 Tween - 20）或 PBST（磷酸鹽緩沖鹽溶液加 Tween - 20） 。Tween - 20 是一種非離子表面活性劑，能夠降低表面張力，幫助去除非特異性結合的抗體 。洗膜次數一般為 3 - 5 次，每次 5 - 10 分鐘。洗膜不充分，就像衣服沒(méi)洗干凈，會(huì )殘留未結合的抗體，導致背景信號過(guò)高；洗膜過(guò)度，則可能會(huì )洗去部分與目標蛋白結合的抗體，使信號減弱 。在洗膜過(guò)程中，要注意輕輕晃動(dòng)容器，讓洗膜液充分接觸膜的表面，確保洗膜效果均勻一致。

總結

Western Blot 實(shí)驗全流程涵蓋了樣本制備、凝膠制備、電泳、轉膜以及免疫檢測等多個(gè)關(guān)鍵步驟，每一個(gè)步驟都如同精密儀器中的一個(gè)部件，任何一個(gè)環(huán)節出現偏差，都可能影響整個(gè)實(shí)驗的結果。從樣本制備時(shí)對裂解液的謹慎選擇，到凝膠制備中對濃度、聚合時(shí)間的嚴格把控；從電泳時(shí)對蛋白上樣量和電壓的精準調控，到轉膜時(shí)對膜的類(lèi)型、孔徑以及轉膜條件的細致考量；再到免疫檢測中對封閉液、抗體孵育和洗膜的精心操作，每一處細節都承載著(zhù)實(shí)驗成功的希望。

在實(shí)際操作中，大家要充分理解每個(gè)步驟的原理和要點(diǎn)，嚴格按照規范進(jìn)行操作，并且不斷積累經(jīng)驗，根據不同的實(shí)驗目的和樣本特點(diǎn)，靈活調整實(shí)驗條件。只有這樣，我們才能在這個(gè)充滿(mǎn)挑戰的實(shí)驗過(guò)程中，獲得準確、可靠的實(shí)驗結果。希望大家在今后的科研道路上，通過(guò)不斷地探索和實(shí)踐，能夠熟練掌握 Western Blot 實(shí)驗技術(shù)，為科研工作的順利開(kāi)展奠定堅實(shí)的基礎，在蛋白質(zhì)研究的領(lǐng)域中收獲更多的成果。