來(lái)源：本站 作者：zhangyang 時(shí)間：2025/2/20

數字PCR檢測如何環(huán)境DNA？不同原理的數字PCR有何區別？

檢測環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）極大地提高了對水生生物的檢測，特別是對稀有或瀕危物種的。通過(guò)聚合酶鏈反應（PCR），可以收集、提取和擴增在正?；顒?dòng)時(shí)從個(gè)體中脫落或排泄的eDNA，以揭示棲息地的物種組成。一些研究開(kāi)始使用定量PCR（qPCR）來(lái)證明DNA估計與豐度或生物量之間的顯著(zhù)相關(guān)性，但也會(huì )出現測不準的情況。不僅如此植物致病菌的診斷也可以通過(guò)環(huán)境DNA提早檢測以提早預防，采用可靠的檢測方法對于在無(wú)害蟲(chóng)地區建立或傳播之前確定害蟲(chóng)的存在至關(guān)重要。下面通過(guò)兩篇文獻來(lái)了解數字PCR在環(huán)境DNA監測中的應用。

實(shí)驗背景

文章一：柑橘類(lèi)細菌性潰瘍?。?/span>CBC），由柑橘黃單胞菌引起的植物疾病。為了在有癥狀或無(wú)癥狀的植物材料中及早檢測出這種病菌，需要對其進(jìn)行及時(shí)的檢測。在本研究中通過(guò)液滴式數字PCR與實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行了檢測，比較兩種檢測方法的準確度以及靈敏度。

文章二：由于繁殖的植物材料只在少數幾個(gè)大型苗圃中生產(chǎn)，然后分發(fā)給位于其他地區或國家的其他苗圃。這樣增加了感染疫霉的植物被引入新地區的風(fēng)險。目前尚無(wú)有效的手段來(lái)控制土源性疫霉菌病，分子診斷可以更準確地鑒定物種，提高疫霉菌的檢測。在本研究中，我們評估了利用dPCR和qPCR在多個(gè)背景基質(zhì)中定量煙疫霉的可行性，包括宿主組織（莖和根）和土壤樣本。

實(shí)驗結果

文章一：研究表明DNA提取方法會(huì )影響檢測試驗的可靠性，但是ddPCR受到的影響更小。較低的細菌濃度下，由于Ct之間的差異較大（特別是在qPCR反應）并且由于技術(shù)重復之間有更大的可變性。但是數字PCR在檢測中更靈敏，且在低濃度樣本的檢測的結果是qpcr的10倍

文章二：盡管dPCR的動(dòng)態(tài)范圍較低（3對數，qPCR為7對數），但該技術(shù)被證明在極低拷貝數下具有非常高的精度。dPCR能夠在較寬的濃度范圍內準確地檢測出所有類(lèi)型樣品中的病原體。dPCR是一種非常精確的煙草桿菌鑒定技術(shù)，這種方法適用于土壤、莖和根的極低拷貝數。

拓展：dPCR的原理及對比

dPCR的原理是通過(guò)有限稀釋將含有目的DNA的PCR反應體系分散成無(wú)數個(gè)單一模板的PCR體系進(jìn)行擴增，再通過(guò)統計檢測結果及泊松分布校正實(shí)現目的DNA的絕對定量。

    dPCR包括三個(gè)步驟：分散體系、PCR擴增和信號檢測。通過(guò)樣品的稀釋和分散形成分散體系，這一步是限制dPCR發(fā)展應用的一個(gè)重要因素，其所引起的分散數量和分散體積的不同極大地影響著(zhù)定量結果的精度與準確性。分散體系的形成增加了靶分子的有效濃度，并在一定程度上對存在干擾的復雜化合物進(jìn)行了純化，提高了靶分子和背景之間的比率?；?/span>dPCR統計的定量方式，反應體系的分散數量越多，低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高，同時(shí)多個(gè)單一的反應單元也為多目標序列的高通量檢測的發(fā)展提供了基礎。分散體積的不同會(huì )對拷貝數結果的測量產(chǎn)生影響，是造成dPCR精度下降的一個(gè)潛在因素，且與檢測限的大小形成反比關(guān)系。

    dPCR系統根據分散方式的不同可分為三種主要類(lèi)型：基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、基于微孔芯片的微孔板數字PCR (micro-chamber digital PCR, mdPCR)和基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數字PCR (microfluidic chip digital PCR, mcdPCR)。

   另外，基于水凝膠珠、瓊脂糖珠和生物打印技術(shù)等樣本分散方式的dPCR雖然尚未商業(yè)化，但在現有的實(shí)驗研究中己取得一定進(jìn)展。微滴式通過(guò)油包裹PCR體系形成無(wú)數個(gè)油包水微滴，每個(gè)微滴是一個(gè)獨立的反應單元，這種特殊的微滴在進(jìn)行PCR時(shí)能夠保證完整的形態(tài)，不會(huì )互相擴散，也阻止PCR混合物液滴在熱擴增過(guò)程的蒸發(fā)；微孔芯片式是利用光刻技術(shù)在硅基上刻蝕出微孔陣列，再通過(guò)表面改性、打磨等操作形成數萬(wàn)個(gè)納升級的表面疏水和孔內壁親水的微反應室；微流控芯片式則是利用微流控芯片裝置使PCR反應體系準確快速地分散于芯片孔中，而每個(gè)孔都是一個(gè)小反應體系(納升級)。

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