來(lái)源：本站 作者：admin 時(shí)間：2019/1/8

【前言】

流式細胞儀最初的研究就是集中于測量發(fā)育異常的細胞遺傳物質(zhì)的數量變化，至今這項技術(shù)仍是植物生物學(xué)中評估基因組的大小和倍性水平參考方法。植物DNA水平的鑒定對植物種質(zhì)資源、物種進(jìn)化、物種分類(lèi)、生態(tài)學(xué)研究、倍體育種等方面具有重要意義。

【方法原理】

      細胞核在提取液中機械地從約1cm² (或20mg) 組織中提取出來(lái)，過(guò)濾后，細胞核被包含PI或者DAPI（SysmexPartec）的染色液染色，隨后在流式細胞儀上檢測。流式細胞儀需配置一個(gè)或者多個(gè)綠色（PI）、藍色（PI）和紫外（DAPI）激發(fā)光源。

圖1 植物倍性分析樣本準備步驟

【核懸液】

過(guò)濾階段可移去組織碎片，然而一些碎片并不能被完全去掉，比如葉綠體、線(xiàn)粒體、可溶性的分類(lèi)混合物、DNA酶和RNA酶等，這些都會(huì )影響分析的質(zhì)量。加入抗氧化劑（亞硫酸鹽、巰基乙醇）、單寧（PVP）、葉綠體裂解液（Triton）、RNA溶解液（RNA酶，冰?。┑瓤梢越档瓦@些物質(zhì)對結果的干擾。

【參照物】

通常情況下，要選擇與待測樣本基因組大小相近的物種作為參照物。這個(gè)參照物需要和樣本一起制備，以降低操作中引入偏差。已知內部參照物的DNA的重量（pg）或者堿基對（bp），通過(guò)參照物和樣本的峰值準確計算待測樣本。兩個(gè)的換算公式為：

DNA 含量(bp) = 0.978 x 10⁹x DNA 含量 (pg)

【流式分析】

      為了清除未過(guò)濾掉的細胞碎片，流式細胞術(shù)通過(guò)SSC vs FL散點(diǎn)圖設門(mén)。

圖2 番茄樣本的倍性分析。

A圖顯示SSCvsFL6(PI發(fā)射)，命名為“Nuclei”的門(mén)應用與B圖中，B柱形圖顯示“Nuclei”門(mén)內FL6峰值。

【核內復制評估】

圖2中使用的番茄樣本顯示出核內復制與DNA復制的相關(guān)性，如有絲分裂，但是沒(méi)有區分核和細胞自身。核內復制的峰是疊加在經(jīng)典的細胞周期峰上的：

2C→4C→8C→16C。還可以同時(shí)查看所以核分布信息，同時(shí)一些巧合也會(huì )產(chǎn)生假的峰‘2C + 4C’。

圖3  番茄樣本中的核復制以及峰值結果統計

【基因組檢測】

      使用流式細胞儀對DNA準確地定量分析需要非堿基特異性的、DNA嵌合型染料。主要的嵌合型染料為PI和EB。

圖4 使用已知DNA含量的大蒜作為參照物分析狗尾草的DNA含量

注：PK1 和PK2 分別為作為參照物大蒜的2C和4C的峰值，PK3 為狗尾草的峰值，從而計算出狗尾草DNA含量 = 123.97/49.50 = 2.50。2C 值計算為2.50 x 34.80 = 87.15 pg。

【AT/CG比例】

這個(gè)原理是基于DNA嵌合染料的使用相對于基數重復的熒光色素。例如，5 x AT Hoechst 33342和3 x GC 光神霉素的AT/GC比例的計算方法：

R_IP=待測物熒光強度/參照物熒光強度  PI檢測

R_HO=待測物熒光強度/參照物熒光強度 Hoechst 33342檢測

R_CA=待測物熒光強度/參照物熒光強度 Chromomycin A3檢測

待測物AT % = 參照物AT% AT (R_HO/R_IP)^1/5和/或 待測物GC% = 參照物GC% (R_CA/R_IP)^1/3

最終得出的：待測物AT % +待測物GC %=100 %

【孤雌生殖和異倍體】

      孤雌生殖是一種不經(jīng)過(guò)受精但產(chǎn)生種子生殖方式。其繁殖后代與母體是相同的。流式圖中的峰是由于種子的胚胎和胚乳細胞由無(wú)特定的孤雌生殖以及孤雌生殖的方式產(chǎn)生。（圖5）

圖5 使用流式細胞儀在柱形圖熒光通道里對繁殖方式的研究

      對于異倍體，峰的位置會(huì )被以下出現的情況影響：油菜籽(Brassica napus)的染色體包含n = 16和n = 19的染色體，因此會(huì )產(chǎn)生雙峰。

【細胞周期】

在生理條件下，細胞自然呈現不同階段的細胞周期的DNA圖譜。

【試劑選擇】

對于植物核含量的檢測，主要的試劑為DAPI和PI，根據實(shí)驗需求和儀器配置，可以對染料進(jìn)行選擇。具體區別羅列如下：

	DAPI	PI
激光光源	365nm	488nm或532nm
染色原理	只染色DNA	同時(shí)染色DNA和RNA
熒光強度	強	弱
熒光分辨率	高，CV<1%	低，CV>3%
激光光斑	大，對光斑定位依賴(lài)小	小，對光斑定位依賴(lài)大
染料毒性	強	低
染料粘附性	小	大
染色時(shí)間	短，<2min	長(cháng)，>30min
結果穩定性	次生代謝對結果影響小	次生代謝對結果影響大
應用	倍性分析，細胞周期	倍性分析，基因組大小分析，細胞周期

常用試劑型號

貨號	英文名稱(chēng)	中文名稱(chēng)	測試數
05-5001	CyStain® UV Ploidy	UV倍性分析試劑盒	250 tests
05-5002	CyStain® UV Precise P	UV精確P倍性分析試劑盒	250 tests
05-5002-a	CyStain® UV Precise P "automate"	UV精確P倍性分析試劑盒—自動(dòng)	2 x 1000 ml
05-5003	CyStain® UV Precise T	UV精確T倍性分析試劑盒	250 tests
05-5003-a	CyStain® UV Precise T "automate"	UV精確T倍性分析試劑盒—自動(dòng)	2 x 1000 ml
05-5004	CyStain® DNA 1 step	DNA一步法	250 tests
05-5005	CyStain® DNA 2 step	DNA二步法	250 tests
05-5022	CyStain® PI Absolute P	PI精確P倍性分析試劑盒	250 tests
05-5022-S	CyStain® PI Absolute P	PI精確P倍性分析試劑盒(小)	50 tests
05-5023	CyStain® PI Absolute T	PI精確T倍性分析試劑盒	250 tests